科研-人4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶（HPD）檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品品牌：睿信生物 商品貨號(hào)：RXSM504260

文獻(xiàn)($TCount)

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反應(yīng)種屬 人
檢測(cè)范圍 1.562ng/ml– 50ng/ml。
物理性能 試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無(wú)沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無(wú)破損漏氣。
用途 用于檢測(cè)血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本中人4-羥基苯丙 酮酸雙加氧酶(HPD)的濃度。
實(shí)驗(yàn)原理 本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。在預(yù)包被抗 人4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPD)抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中，加 入人4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPD)校準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，再加入生物素標(biāo) 記抗體，經(jīng)過溫育與充分洗滌后，再加入HRP偶聯(lián)的親和素，經(jīng)過溫育 與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原 生物素標(biāo)記抗體-親和素酶的夾心復(fù)合物。加TMB顯色液，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物， 在終止液作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)上測(cè)定吸光度 （OD值），吸光度（OD值）與待測(cè)樣品中人4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶 (HPD)的濃度正相關(guān)。擬合校準(zhǔn)品曲線，可以計(jì)算出樣本中人4-羥基苯丙 酮酸雙加氧酶(HPD)的濃度。
特異性 本試劑盒識(shí)別天然人4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPD)，與結(jié) 構(gòu)類似物無(wú)交叉。
重復(fù)性 批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于 15%，批間變異系數(shù) CV%小于 15%。
回收率 回收率在 85%-115%之間
試驗(yàn)所需自備試驗(yàn)器材 1、酶標(biāo)儀（450nm）
2、精密移液器及一次性吸頭
3、蒸餾水
4、洗瓶或者自動(dòng)洗板機(jī)
5、37℃水浴鍋或恒溫箱
6、500ml 量筒
操作程序 1. 將各種試劑移至室溫平衡兩小時(shí)，取濃縮洗滌液，根據(jù)當(dāng)批檢測(cè)數(shù)量，用蒸餾水 1：20 稀釋，混勻后備用。
2. 將預(yù)包被板從密封袋中取出，設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔，不加任何液體；每個(gè)校準(zhǔn)品設(shè) 2 孔，每孔加入對(duì)應(yīng)校準(zhǔn)品 50μl；其余每個(gè)檢測(cè)孔直接加待測(cè)血清或質(zhì)控品 50μl。
3. 除空白孔外所有孔加入生物素化抗原 50μl，混勻，貼上封板膜，置 37℃溫育 60 分鐘。
4. 手工洗板：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置 10 秒甩干，重復(fù) 3 次后拍干。洗板機(jī)洗板：選擇洗滌 3 次程序洗板后拍干。
5. 每孔加入酶標(biāo)親合素 50μl（空白對(duì)照孔除外），混勻，貼上封板膜，置 37℃溫育 30 分鐘。
6. 手工洗板：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置 10 秒甩干，重復(fù) 3 次后拍干。洗板機(jī)洗板：選擇洗滌 3 次程序洗板后拍干。
7. 每孔加顯色劑 A 50μl，顯色劑 B 50μl，振蕩混勻后，置 37℃避光顯色 15 分鐘，每孔加終止液 50μl。
用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長(zhǎng)450nm，先用空白對(duì)照孔調(diào)零點(diǎn)，然后測(cè)定各孔光密度值（OD值）。
注意事項(xiàng) 1：如果試劑盒的組份需要再次使用，請(qǐng)確保上一次使用之后沒有被污染。
2：酶標(biāo)板單次未使用完，要謹(jǐn)記密封放到 2-8℃保存。
問題分析 ①問題描述：標(biāo)準(zhǔn)曲線差
可能原因及相應(yīng)對(duì)策：
1.試劑盒平衡時(shí)間不夠——不低于 2 個(gè)小時(shí)的室溫平衡
2.吸取及洗滌不充分——充分的吸取及洗滌
3.移液不精確——檢查和校正移液器
②問題描述：精密度低
可能原因及相應(yīng)對(duì)策：
1.洗滌不充分——按說明書要求充分洗滌和浸泡
2.混勻不充分和吸取試劑不足——充分混勻和吸取試劑
3.重復(fù)利用吸頭、容器和覆膜——使用加樣器要更換新的吸頭、使用新的封板模
4.加樣不精確——檢查和校正移液器
③問題描述：O.D值低
可能原因及相應(yīng)對(duì)策：
1.每孔加的試劑量不精確——校正移液器，精確加入試劑
2.溫育時(shí)間不正確——保證充足的溫育時(shí)間
3.溫育溫度不正確——試劑要平衡至室溫并保證準(zhǔn)確的溫育溫度
4.酶標(biāo)記物或底物失效——通過混合酶標(biāo)記物和底物，顏色迅速顯現(xiàn)來(lái)檢查
5.沒有加入終止液——按照說明書實(shí)驗(yàn)操作步驟加入終止液
6.超出讀數(shù)時(shí)間讀數(shù)——在說明書推薦的讀數(shù)時(shí)間內(nèi)讀數(shù)
④問題描述：樣本值
可能原因及相應(yīng)對(duì)策：
1.不正確的樣本儲(chǔ)存方式——正確儲(chǔ)存樣本，使用新鮮樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
2.不正確的樣本收集和處理方法——采取正確的樣本收集和處理方法
3.待測(cè)物質(zhì)在樣本中含量低——使用新鮮樣本，重復(fù)實(shí)驗(yàn)
聲明 該試劑盒僅供研究使用，如將其用于臨床診斷或任何其他用途，我公司將不對(duì)因此產(chǎn)生的問題負(fù)責(zé)，亦不承擔(dān)任何法律責(zé)任。

 ELISA試劑盒常見問題與解析

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）作為實(shí)驗(yàn)室的“金牌檢測(cè)員”，在疾病診斷、生物標(biāo)志物檢測(cè)、藥物研發(fā)等領(lǐng)域大顯身手。但再成熟的技術(shù)，也可能因?yàn)橐粋�(gè)小細(xì)節(jié)“鬧脾氣”——標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合不佳、信號(hào)忽高忽低、背景噪音干擾……別擔(dān)心！睿信生物憑借多年ELISA研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，幫你揪出問題根源，讓實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)穩(wěn)當(dāng)當(dāng)！

一、ELISA實(shí)驗(yàn)常見問題大盤點(diǎn)

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線“翻車”——擬合度差、線性不佳

問題表現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線的R²值低于0.99，甚至出現(xiàn)“S”形或雜亂無(wú)章的趨勢(shì)。
可能原因：

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋錯(cuò)誤（梯度沒做好或混勻不充分）。

標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融導(dǎo)致降解。

酶標(biāo)板洗滌不徹底，孔間殘留液體影響吸光度。
解決方案：

標(biāo)準(zhǔn)品現(xiàn)配現(xiàn)用，避免多次凍融，稀釋時(shí)嚴(yán)格按說明書操作。

確保洗滌步驟規(guī)范，洗板機(jī)噴嘴無(wú)堵塞，手工洗板時(shí)甩干并拍干。

如果曲線仍不理想，嘗試更換標(biāo)準(zhǔn)品或檢查酶標(biāo)儀波長(zhǎng)是否準(zhǔn)確。

 

2. 信號(hào)值太低——目標(biāo)蛋白“隱身”了？

問題表現(xiàn)：樣本OD值接近空白孔，無(wú)法有效檢測(cè)目標(biāo)蛋白。
可能原因：

樣本中目標(biāo)蛋白濃度過低（低于檢測(cè)下限）。

抗體失效或孵育時(shí)間/溫度不足。

樣本處理不當(dāng)（如反復(fù)凍融、未加蛋白酶抑制劑）。
解決方案：濃縮樣本（超濾離心）或換用高靈敏度ELISA試劑盒。

檢查抗體有效期，確保孵育時(shí)間充足（可適當(dāng)延長(zhǎng)）。

新鮮樣本優(yōu)先，避免反復(fù)凍融，必要時(shí)添加保護(hù)劑。

3. 背景信號(hào)高——全是“噪音”怎么辦？

問題表現(xiàn)：空白孔或陰性對(duì)照OD值偏高，影響結(jié)果判讀。
可能原因：

封閉不充分（封閉液選擇不當(dāng)或時(shí)間不足）。

抗體交叉反應(yīng)或非特異性結(jié)合。

洗滌不徹底，殘留試劑導(dǎo)致假陽(yáng)性。
解決方案：

優(yōu)化封閉條件（常用BSA或脫脂奶粉，封閉時(shí)間可延長(zhǎng)至1-2小時(shí)）。

增加洗滌次數(shù)（如從3次增至5次），確保每孔洗滌液加滿。

更換特異性更高的抗體，或調(diào)整一抗/二抗稀釋比例。

4. 重復(fù)性差——同一樣本結(jié)果忽高忽低

問題表現(xiàn)：同一批樣本檢測(cè)，孔間差異大，CV值超過20%。
可能原因：

加樣操作不一致（手法、速度差異）。

酶標(biāo)板邊緣效應(yīng)（邊緣孔蒸發(fā)快，溫濕度不均）。

試劑未平衡至室溫直接使用。
解決方案：

使用多通道移液器，統(tǒng)一加樣速度和角度。

孵育時(shí)覆蓋板蓋，避免邊緣孔干燥，可棄用邊緣孔作空白。

所有試劑使用前室溫平衡30分鐘，避免溫度差異影響反應(yīng)效率。

二、ELISA實(shí)驗(yàn)小貼士：細(xì)節(jié)決定成敗

1.樣本處理：血清/血漿避免溶血，細(xì)胞裂解液需離心去除碎片，組織樣本勻漿充分。

1. 

2.試劑保存：抗體、酶結(jié)合物等按說明書要求保存（-20℃分裝避免反復(fù)凍融）。

3.儀器校準(zhǔn)：定期檢查移液器準(zhǔn)確性，酶標(biāo)儀做波長(zhǎng)和光路校準(zhǔn)。

4.對(duì)照設(shè)置：每板必設(shè)空白孔、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，監(jiān)控系統(tǒng)誤差。

三、遇到問題別慌！ELISA排查流程圖

如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果異常，可以按以下步驟快速排查：

檢查試劑：是否過期？是否正確保存？

 

回顧操作：孵育時(shí)間、溫度、洗滌步驟是否規(guī)范？

 

分析數(shù)據(jù)：標(biāo)準(zhǔn)曲線是否正常？對(duì)照是否符合預(yù)期？

 

重復(fù)實(shí)驗(yàn)：換新試劑或調(diào)整條件后重試。

ELISA雖然操作簡(jiǎn)單，但“細(xì)節(jié)魔鬼”常常藏在加樣、洗滌、孵育這些基礎(chǔ)步驟里。遇到問題時(shí)，耐心對(duì)照說明書、排查關(guān)鍵環(huán)節(jié)，往往能事半功倍。如果反復(fù)失敗，不妨聯(lián)系試劑盒技術(shù)支持——畢竟，好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果=靠譜的試劑+規(guī)范的操作+一點(diǎn)點(diǎn)的運(yùn)氣！

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