Western Blot 常見問題分析（二）

發(fā)布時(shí)間：2020/6/2 15:21:41      閱讀次數(shù)：2223

 

Western Blot是實(shí)驗(yàn)室中常見且重要的一種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,通常我們在日常交流中說的就是簡稱“WB”,中文名稱是“蛋白印跡”或“免疫印跡”,其核心本質(zhì)是抗原抗體的特異性反應(yīng),通常用來判斷特定蛋白在樣本中是否表達(dá)及粗略分析特定蛋白表達(dá)量的高低.


在上周文章“Western Blot 常見問題分析”,我們講到了Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果中常見的條帶弱 條帶彎曲和彌散三種現(xiàn)象,這次我們再來講講蛋白提取時(shí)需注意的地方及結(jié)果條帶雜帶多 背景臟等常見問題.

 

<  蛋 白 提 取  >

 

以裂解組織樣本提取蛋白為例,操作步驟簡易如下：

組織剪成小塊→ 按一定比例加入裂解液→ 勻漿→ 充分裂解后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)


當(dāng)我們用RIPA裂解液時(shí),常會發(fā)現(xiàn)裂解產(chǎn)物中有一小團(tuán)透明的膠狀物質(zhì).不用擔(dān)心,這是正�，F(xiàn)象,這團(tuán)膠狀物是含有基因組DNA等的復(fù)合物.如果檢測的蛋白不是和基因組結(jié)合特別緊密的,可以直接離心后取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),當(dāng)然也可以超聲打散再離心取上清.

在提取蛋白時(shí),我們需注意：

1. 盡可能采用簡單方法進(jìn)行樣品處理,避免蛋白丟失；

2. 根據(jù)蛋白定位選擇合適的裂解緩沖液,并加入合適的蛋白酶抑制劑,避免蛋白降解,從而保證檢測的準(zhǔn)確性；

3. 低溫和蛋白酶抑制劑可以減少蛋白的降解,所有離心機(jī)需提前預(yù)冷,所有操作在冰上完成；

4. 樣品裂解液應(yīng)新鮮制備,并且分裝凍存于-80℃,切勿反復(fù)凍融已經(jīng)制備好的樣品.
 

<  常 見 問 題 之 雜 帶 多  >

 

原因分析1：曝光時(shí)間太長；
解決方案1：縮短曝光時(shí)間；
原因分析2：抗體 抗原濃度高；
解決方案2：降低抗體 抗原濃度,建議用含5%脫脂奶粉的TBST稀釋二抗；
原因分析3：交叉反應(yīng)性,抗體質(zhì)量問題；
解決方案3：選擇單克隆抗體,選擇高品質(zhì)的抗體.

 

<  常 見 問 題 之 背 景 臟  >

 

原因分析1：緩沖液污染；
解決方案1：使用新配制的緩沖液,緩沖液最好現(xiàn)用現(xiàn)配；
原因分析2：封閉不完全,封閉液選擇有誤；
解決方案2：延長封閉時(shí)間,推薦正常血清做封閉液；
原因分析3：膜污染,漂洗不完全；
解決方案3：更換新膜,操作中戴手套,用鑷子夾膜,避免直接接觸膜；增加漂洗時(shí)間和緩沖液體積；


BSA 血清和脫脂奶粉作為封閉液區(qū)別：

BSA是最常用的封閉液,成分單一適用于大多數(shù)情況,不可用于偶聯(lián)BSA的免疫原的封閉.


血清的封閉主要有兩方面,一方面是封閉待測樣本某些物質(zhì)與蛋白非特異性的結(jié)合,從而降低背景,從這點(diǎn)看,血清和BSA沒有明顯區(qū)別.另一方面是待測樣品中可能會有Fc受體,Fc受體與抗體的結(jié)合與特異性無關(guān),而封閉血清中有抗體可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間的結(jié)合,BSA無法封閉Fc受體.


脫脂奶粉的成分相對復(fù)雜,較BSA和血清應(yīng)用要少一些.脫脂奶粉中含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留,在使用生物素-親和素系統(tǒng)和堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗時(shí),會造成高背景或本底水平增高.


<  常 見 問 題 之 分 子 量 錯(cuò) 誤  >

原因分析1：分子量偏大,可能蛋白發(fā)生糖基化 甲基化修飾,融合了標(biāo)簽蛋白；
解決方案1：查找文獻(xiàn)看下是否蛋白發(fā)生修飾,將融合的標(biāo)簽蛋白分子量與目的蛋白分子量相加,為正確的分子量.

原因分析2：分子量偏小,可能存在不同的剪接體或者目的蛋白被降解；
解決方案2：查閱文獻(xiàn)或者通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種不同的編碼mRNA,確保蛋白樣本未被污染,確保含有蛋白酶抑制劑.


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