發(fā)布時(shí)間:2019/7/16 6:31:05 閱讀次數(shù):1972
Western Blot,通常我們在日常交流中說的就是簡稱“WB”,中文名稱是“蛋白印跡”或“免疫印跡”,其核心本質(zhì)是抗原抗體的特異性反應(yīng)。Western Blot的基本原理是蛋白質(zhì)通過凝膠電泳后,按分子量大小順序在分離膠中分離開來,通過轉(zhuǎn)膜可將膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體(通常是PVDF膜、NC膜和尼龍膜)表面,然后加入一抗去特異性結(jié)合膜上蛋白質(zhì),再加入酶或者熒光素標(biāo)記的二抗,二抗與一抗結(jié)合反應(yīng)后,通過底物顯色、化學(xué)發(fā)光等方法檢測目的蛋白。Western Blot實(shí)驗(yàn)一般用來判斷特定蛋白在樣本中是否表達(dá)及粗略分析特定蛋白表達(dá)量的高低。
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轉(zhuǎn)膜具體情況 | 要點(diǎn)和建議 |
大分子量蛋白 | 1)大的蛋白傾向于在膠里沉淀,阻礙轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)膜緩沖液里加入0.1%的SDS有助于解除上述現(xiàn)象; 2)甲醇傾向于從蛋白上移除SDS,因此把甲醇濃度降到10%甚至更少,有助于減少上述沉淀現(xiàn)象, 適用于大分子量蛋白轉(zhuǎn)膜; 3)用4℃濕轉(zhuǎn)過夜代替半干法轉(zhuǎn)膜。 |
小分子量蛋白 | 1)SDS阻礙蛋白和膜的結(jié)合,但小分子量蛋白受到的影響更大。若轉(zhuǎn)膜的蛋白很小,可以考慮去掉 緩沖液里的SDS; 2)保持甲醇濃度在20%; 3)對于非常小的蛋白,不要用半干法。 |
膜的方向確定 | 轉(zhuǎn)移后剪角做標(biāo)記,分清正反面;用鉛筆做記號(hào)或電泳時(shí)Marker上成非對稱的。 |
轉(zhuǎn)膜后背景高 | 選擇NC膜;另外,雞的抗體傾向于和PVDF膜及一些尼龍膜結(jié)合而導(dǎo)致高背景;可以換成NC膜以減 少背景。 |
轉(zhuǎn)膜時(shí)污染 | 避免手指觸碰膜,可以用鑷子來取膜。手指上的油脂和蛋白質(zhì)會(huì)阻礙有效的轉(zhuǎn)膜,也會(huì)弄臟雜交。 |
濾紙的大小 | 確保濾紙和膜的大小與膠一致。當(dāng)使用半干法轉(zhuǎn)膜時(shí),過多的部分會(huì)阻礙電流穿過膜。 |
解決方案4:增加抗體濃度,注意抗體儲(chǔ)存條件(避免反復(fù)凍融);
抗體的保存和使用:
1 收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進(jìn)行分裝盒保存;
2 對于大部分抗體,比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃
2.1 分裝的量以一次實(shí)驗(yàn)用為好,最好不能少于10ul每份,因?yàn)榉盅b體積越小,抗體的濃度越可能受到蒸發(fā)及管壁吸附的影響;
2.2 復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4℃,避免再凍起來;
3 大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。
任何時(shí)候,絕對避免反復(fù)凍融。
原因分析5:抗體孵育時(shí)間不足;
解決方案5:建議一抗4度孵育過夜;相對于2小時(shí)孵育,一抗4度過夜孵育會(huì)顯著增加抗體的結(jié)合。
原因分析1:條帶向上彎曲(︶ 條帶呈笑臉狀):凝膠制備不均勻,中間冷卻不好; 解決方案1: 分離膠配好后用水壓線,保證水平,配膠緩沖液現(xiàn)用現(xiàn)配,混合均勻后制膠。 | |
原因分析2:條帶向下彎曲(︵ 條帶呈皺眉狀):可能是由于裝置不合適,特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡; 解決方案2:制膠架裝配好后,用水檢查是否有空隙再灌膠。 | |
原因分析3:條帶顯示不均勻,中空:可能凝固太快導(dǎo)致聚合不均勻; 解決方案3:使用合適的促凝劑,制膠液混合好后及時(shí)灌膠 |
原因分析1:加樣過量; 解決方案1:降低上樣量,推薦每孔上樣20-30ug。 | 原因分析4:電極不平衡,加樣位置偏斜; 解決方案4:電泳槽水平放置,配膠時(shí)盡量小心,確保每個(gè)加樣孔完好無損。 | |
原因分析2:蛋白降解; 解決方案2:使用蛋白酶抑制劑。 | ||
原因分析3: 樣品溶解不好; 解決方案3:樣品制備中一定要充分勻漿并超聲裂解。 | 原因分析5:樣品中含有不可溶顆粒; 解決方案5:緩沖液配好后過濾除菌,樣品裂解保證可溶性 |
更多實(shí)驗(yàn)常見問題留待下次討論,敬請期待。